スーパーオキシドから構成される新規ハイブリッドタンパク質

Scientific Reports volume 13、記事番号: 6892 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

スーパーオキシドジスムターゼ活性Cu(II)複合体(CuST)とリゾチーム(CuST@lysozyme)から構成される新規ハイブリッドタンパク質を調製した。分光分析および電気化学分析の結果、CuST がリゾチームに結合することが確認されました。 CuST@リゾチームの結晶構造を0.92Åの分解能で決定したところ、リゾチームのHis15イミダゾール基がCuSTの赤道位置のCu(II)中心に結合していることが明らかになりました。さらに、CuST は、Thr89 ヒドロキシル基の弱い軸配位と、Arg14 残基のグアニジニウム基と CuST のヒドロキシル基の間の水素結合によって、所定の位置に固定されました。さらに、CuST とリゾチームの組み合わせは、CuST のスーパーオキシドジスムターゼ活性を低下させませんでした。スペクトル、電気化学、構造研究、および量子化学計算に基づいて、CuST@リゾチームによって触媒される O2-不均化機構が提案されています。

好気性生物は、好気呼吸によって生命を維持するために必要なエネルギーを生成します。ヒドロキシルラジカル (・OH)、一重項酸素 (1O2)、過酸化水素 (H2O2)、スーパーオキシド (O2-) などの活性酸素種 (ROS) は、このプロセスの避けられない副産物です。これらの ROS は、脂質、炭水化物、ホルモン、タンパク質、核酸などの生体分子に深刻な酸化損傷を引き起こします。これらの ROS のうち、O2- は電子伝達系、食作用プロセス、酵素酸化、ヘモグロビンやミオグロビンなどの酸素運搬タンパク質によって生成されます1。プロトン条件下では、O2- はプロトン (H+) と反応して、·OH や H2O22 などの他の ROS を生成します。したがって、O2– の除去は好気性生物にとって優先事項です。 O2- を除去し、O2- によって引き起こされる酸化損傷を回避するために、好気性生物はスーパーオキシドジスムターゼ (SOD) として知られる金属酵素を持っています。反応 (1) に示すように、SOD は O2- から H2O2 および O2 への不均化を触媒します。

SOD は生体分子を酸化損傷から保護する上で重要な役割を果たすため、生物の平均寿命は効率的な SOD 活性に依存します。 SOD 活性が高い生物は死亡率が低く、その逆も同様です3。金属イオンは SOD の活性中心にあり、O2- の不均化を触媒して、反応 (2) および (3) を介してそれぞれ H2O2 と O2 を生成します。

活性中心に存在する金属イオンに基づいて、SOD は 4 つのカテゴリに分類されます。 Ni、Fe、Mn、Cu、Zn を含む SOD は、NiSOD4,5,6,7,8、FeSOD9,10,11,12,13、MnSOD14,15,16,17,18,19、および CuZnSOD20 として知られています。それぞれ21、22。この研究では、活性中心に Cu(II) および Zn(II) イオンを含む最も一般的な CuZnSOD に焦点を当てました。 Zn(II) イオンは活性中心の周囲の二次配位構造を固定します 23。以下の反応 (4) および (5) に示すように、Cu(II) イオンは O2- の不均化反応を触媒します。

天然の CuZnSOD を O2 除去剤として使用するには、その高コストや不安定性などの問題を解決する必要があります24。これに関連して、低分子量の Cu(II) 錯体が機能的な SOD モデルとして報告されています 25,26。これらの Cu(II) 錯体のうち、サリチル酸を配位子として配位した錯体は、機能性 SOD モデルとして報告されています 26。私たちのグループは、フェノラート部分と L-アミノ酸部分から構成される Cu(II) 錯体も報告しました 27。しかし、これらの配位化合物は、リガンドから Cu(II) イオンが放出された後、生体分子に対して有毒となる可能性があります 28。この問題を解決するために、我々はタンパク質の強力な Cu(II) イオン結合能力に焦点を当てました 29。

この研究では、最初のアプローチとして、安定性と結晶性を考慮して選択したリゾチームと機能的なSOD模倣Cu(II)複合体から構成されるハイブリッドタンパク質の形成を調査しました。この SOD 模倣ハイブリッドタンパク質は、機能的な SOD モデル Cu(II) 複合体の生体適合性と安定性を改善すると期待されていました。

14), forming an imidazolate anion. When the pH of the solution is between 6 and 14, the imidazole group is neither protonated nor deprotonated. Therefore, in pH 7.0 solution, imidazole can bind to the Cu(II) center in the neutral state. Although this UV–vis spectral behavior was not sufficiently quantitative to determine the binding constants, the spectral change was qualitatively saturated. In addition, CuST-Imi was obtained through the reaction of CuST with 1 eq. of imidazole in good yield (77.8%). Based on these results, we presume that CuST binds sufficient well with the imidazole group of His15./p>

> 2000 μM). Both CuST-Imi and CuST showed higher SOD activities than CuCl2, indicating that the SOD activity of the CuST unit was retained, even when CuST was bound to lysozyme. These results indicated that lysozyme acquired SOD activity by forming a composite with CuST. Unfortunately, the SOD activity of the CuST unit did not improve upon binding to lysozyme. This is because the hydroxyl group of CuST forms hydrogen bonds with the guanidinium group of Arg14, neutralizing the positive charge. As a result, O2– ions cannot form strong electrostatic interactions with the guanidinium group of Arg14, although hydrogen bonds play an important role in fixing the CuST unit to lysozyme./p>

was compared to the expected S(S + 1) for the spin state (doublet state). In all the calculations performed, the spin contamination was found to be less than 3% and therefore negligible. The structures of the complexes were visualized using ChemCraft software Ver. 1.660. To model the optical properties, the 120 lowest excitation states were chosen. An increasing number of excitations resulted in bands in the deep-ultraviolet region of the spectrum, which was not the target region of this research. Calculations were performed for the isolated molecules and molecules in the solvent medium (water). A polarizable continuum model was adopted for the latter61. The molar absorptivity, ε (L mol−1 cm−1), was calculated using the GaussSum 3.0 program package62. The g-tensor and hyperfine coupling constants (A-tensor) were calculated using the ORCA 5 program package63. A hybrid Becke three-parameter functional (B3LYP) was used in combination with the Pople basis set (6-311G(d,p)). The A-tensor was obtained as the sum of three contributions: the isotropic Fermi contact (AFC), anisotropic dipolar (\({\mathrm{A}}_{x, y, z}^{D}\)), and spin–orbit coupling term \({(\mathrm{A}}_{x,y,z}^{SO})\). This approximation reproduces the target parameters64,65./p>